1. Прошу предоставить следующую информацию о ПЦР-тестах на SARS-CoV-2, когда-либо использовавшихся для формирования статистики заболеваемости Ковид-19 в России:
· количество циклов амплификации (общее Cn или, для количественных тестов, значение порогового Ct, при достижении которого анализ считается ковид-отрицательным);
· предел обнаружения (количество в пробе искомого РНК, позволяющее давать ковид-положительный результат теста). Росздравнадзор не предоставил информацию о количестве циклов и пределе обнаружения. Мы должны убедиться в том, что ПЦР-тесты не использовали количество циклов, делающее результаты ненадёжными, и не обоснованные нормативными актами пределы обнаружения;
· Дата испытания теста в соответствии с Порядком, утвержденным приказом Минздрава России от 09.01.2014 № 2н. Росздравнадзор не предоставил конкретную информацию об испытаниях, сославшись на то, что все тесты зарегистрированы в установленном порядке, а это предполагает испытания. Однако, порядок регистрации, предусмотренный Постановлениями 430 и 1826 отменяет обязательность испытаний для данных медицинских изделий на период действия Постановлений. В условиях, когда нам недоговаривают, мы не можем принять на веру ответ Росздравнадзора. В Государственном реестре медицинских изделий (https://roszdravnadzor.gov.ru/services/misearch) информация об испытаниях не указывается, однако она является существенной для принятия решений об ограничении прав и свобод граждан в связи с «угрозой возникновения и распространения инфекционных заболеваний».
2. Каково количество РНК SARS-CoV-2 в пробе, позволяющее давать ковид-положительный результат теста? Какими нормативными документами это регламентируется?
3. Каково количество циклов амплификации в процедуре ПЦР (ОТ ПЦР), начиная с которого результаты тестирования для любой тест-системы на вирус SARS-CoV-2 можно признать ненадёжными?
4. Есть ли среди ПЦР тест-систем на SARS-CoV-2, зарегистрированных в России, такие, которые не удовлетворяют Вашим ответам по пп.2 и 3?
5. Происходили ли изменения правил проведения ПЦР-тестирования или интерпретации его результатов в документации производителей, рекомендациях, правилах и других документах в течение 2020−2021 годов? Имеются в виду изменения, способные повлиять на статистику по SARS-CoV-2. О таких изменениях, например, говорится в обращении ВОЗ от 14 декабря 2020 года (https://web.archive.org/web/20 210 120 083 427/https:/www.who.int/news/item/14−12−2020-who-information-notice-for-ivd-users).
6. Первый протокол ПЦР-тестирования на SARS-CoV-2, рекомендованный ВОЗ (https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/whoinhouseassays.pdf) (протокол Кормана-Дростена), подвергся серьёзной научной критике (https://cormandrostenreview.com/). Есть ли среди ПЦР-тестов из п. 1 использующие какие-либо подвергаемые сомнению подходы протокола Кормана-Дростена? Есть ли в России открытый доступ к протоколам и возможность их научной критики? (Росздравнадзор предоставил информацию только об иностранных протоколах).
7. Неоправданно высокая концентрация праймеров в наборах для ПЦР может приводить к увеличению неспецифических связываний в ходе амплификации. Существуют ли нормативные рамки для контроля производителей в выборе концентрации праймеров? Как Вы оцениваете в этом отношении тесты, используемые в России?
8. Располагает ли ХХХ (гос.структура) полным списком праймеров и зондов, используемых ПЦР-тестами, указанными в п. 1? Просьба предоставить этот список.[i] Если не располагает, то просьба сообщить, куда нам обратиться (Росздравнадзор список не предоставил).
9. Есть ли среди указанных праймеров и зондов комплиментарные нуклеотидным последовательностям, обнаруживаемым в человеке вне зависимости от присутствия предполагаемого вируса SARS-CoV-2 — как в человеческом геноме, так и в частицах и микроорганизмах, являющихся частью нашего микробиома, т. е. постоянно циркулирующих в человеческом теле, а также регулярно попадающих в него из окружающей среды?[ii] Имея неудовлетворительный опыт обращения с этими вопросами в Росздравнадзор, который в этом и некоторых других вопросах дал ответы, но не по существу, просим ответить «Да» или «Нет». В случае ответа «Да» просьба прокомментировать необходимость выбора таких последовательностей и влияние этого выбора на корректность результатов тестирования.
10. Сравнением с каким «золотым стандартом» оценивается точность (чувствительность и специфичность) ПЦР-тестов на SARS-CoV-2? Здесь под «золотым стандартом» имеется в виду метод определения, дающий максимально правильный результат, и не включающий в себя проверяемый тест (как для тестов на беременность золотым стандартом будет проверка такого однозначного симптома, как наличие действительной беременности, а для теста на стафилококк — наличие самой культуры стафилококка). Росздравнадзор сообщил, что «с точки зрения постановки окончательного диагноза любого вирусного инфекционного заболевания, в том числе COVID-19, „золотым стандартом“ является оптимальное сочетание диагностических методов, включающих не только лабораторное, но и клиническое и инструментальное обследование пациента». Почему в случае вирусных инфекций «золотым стандартом» считается «сочетание диагностических методов», а не наличие выделенного должным образом вируса?
11. В Национальном исследовательском центре эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения РФ налажено производство стандартных образцов инактивированного штамма «ГК2020/1» коронавируса SARS-CoV-2 (описание типа ГСО 11 661−2020). Используете ли Вы их в своей работе?
12. Термин «инактивированный» предполагает наличие активного вируса, который тем или иным образом инактивирован. Учитывая, что «вирус» предположительно отличается высокой изменчивостью, просим пояснить, как производитель (НИЦЭиМ имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения РФ) обеспечивает при серийном производстве точное соответствие стандартных образцов Описанию типа стандартного образца, которое включает точное перечисление последовательности 8629 нуклеотидов. В каком состоянии в инактивированном штамме «ГК2020/1» в составе стандартных образцов находятся ещё порядка 21 000 нуклеотидов из генома вируса SARS-CoV-2?
13. Являются ли стандартные образцы инактивированного штамма «ГК2020/1» коронавируса SARS-CoV-2 по описанию типа ГСО 11 661−2020 синтезированным изделием (т.е. не вырабатываются инактивированием из природного вирусного материала)? Просим ответить «Да» или «Нет», с комментариями при необходимости.
14. Является ли получение непосредственно из проб (тканей, мокрот и т. д.) больных очищенного вирусного концентрата, т. е. массы вирионов, не имеющей включений другого биологического материала, такого как иных вирусных и невирусных частиц, необходимым этапом работ по изучению вирусов, в том числе по определению их реальной патогенности, тропизма к тканям и клеткам, иммунного ответа? Мы намеренно не используем термин «вирусный изолят», поскольку его зачастую используют для обозначения всего лишь супернатанта (концентрата, содержащего неопределённое множество разных типов генетической информации человеческого, бактериального, грибкового и другого происхождения) или погибшей клеточной культуры, в которой проводили «размножение вируса», и термин «вирусный образец», поскольку это может быть синтезированное изделие. Просим обратить внимание на формулировку «непосредственно из проб» и на то, что речь идёт о необходимости, а не о достаточности. Просим ответить «Да» или «Нет», с комментариями при необходимости (например, о необходимой степени очистки).
15. Является ли выделение непосредственно из проб больных РНК (рибонуклеиновой кислоты) вируса как цельной молекулы, как вещества, очищенного от примесей, необходимым этапом для геномного секвенирования и создания на этой основе тестов? Просим ответить «Да» или «Нет», с комментариями при необходимости.
16. Располагает ли ХХХ оборудованием для исключительно физических методов (фильтрация, центрифугирование и др.) выделения частиц размером 50−200 нанометров (размер предполагаемого вириона SARS-CoV-2)? Просим ответить «Да» или «Нет», с комментариями при необходимости.
17. Имеет ли ХХХ доступ к полученному непосредственно из проб больных и очищенному вирусному концентрату SARS-CoV-2, не имеющему включений другого биологического материала, такого как иных вирусных и невирусных частиц? Просим ответить «Да» или «Нет», с комментариями при необходимости. В случае ответа «Да» просим дать численную характеристику чистоты вирусного концентрата. Росздравнадзор ушёл от прямого ответа на вопрос «Располагает ли Росздравнадзор очищенным вирусным изолятом SARS-CoV-2», сообщив лишь, что «При проведении испытаний ПЦР тест-систем возможно использование различных штаммов коронавируса SARS-CoV-2 <…>, депонированных в коллекциях организаций, имеющих соответствующие полномочия». Поэтому просим обратить внимание, что нас интересует «доступ», как возможность изучения и работы с вирусом, а не юридический факт обладания вирусным концентратом на основании права собственности или на любых других основаниях.
18. С помощью каких процедур получены вирусные концентраты, с которыми Вы работали?[iii] (методы, связанные с наблюдением цитопатического эффекта в клеточных культурах можно объединить термином «культуральные методы»). Если использовались исключительно культуральные методы, то с чем это связано?
19. Если использовалась процедура выделения «культуральным методом», то проводились ли в ходе неё контрольные эксперименты (добавление в клеточную культуру всех тех же веществ, используемых в процедуре выделения, за вычетом компонентов с предполагаемым «вирусом») с целью установления причины цитопатического эффекта? Просим ответить «Да» или «Нет», с комментариями при необходимости. В случае ответа «Да», просим предоставить публикации или другую подтверждающую информацию. В случае ответа «Нет» просим сообщить, есть ли у Вас подробная информация о проведении полноценных контрольных экспериментов в ходе выделения SARS-CoV-2 в мире (всё, что мы нашли — упоминание слова «mock» и одну-две фотографии в статьях о «выделении»). Если таковой нет, есть ли подобная информация применительно к выделению любого другого вируса? Доказывает ли она связь цитопатического эффекта с действием вируса?
20. Имеют ли специалисты ХХХ возможность и пользовались ли ею для а). различения и б). физического разделения вирусных и вирусоподобных частиц (таких как внутри- и внеклеточные визикулы сравнимых с вирусами размеров) в супернатанте или в суспензии клеточной культуры после цитопатического эффекта? В статье Giannessi F, Aiello A, Franchi F, Percario ZA, Affabris E. The Role of Extracellular Vesicles as Allies of HIV, HCV and SARS Viruses. Viruses. 2020;12(5):571. Опубликовано 22 мая 2020. doi:10.3390/v12050571 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7291340/) сказано: «В настоящее время практически невозможно разделить внеклеточные визикулы и вирусы с помощью канонических методов выделения (изоляции) визикул, таких как дифференциальное центрифугирование, потому что зачастую эти частицы сбиваются вместе из-за своих одинаковых размеров. Чтобы преодолеть эту проблему различные исследования предлагают разные подходы, такие как использование различий в скорости движения сквозь градиент плотности или специфических маркеров, отличающих вирусы от внеклеточных везикул. Однако, к настоящему времени, надёжного способа, способного гарантировать полное разделение не существует». Просим дать ответы в форме «Да» или «Нет», с комментариями при необходимости. В случае ответов «Да» просим дать ссылку на соответствующие публикации или другие подтверждающие материалы. В случае ответа «Нет» просим сообщить, имеете ли Вы данные о таких публикациях в мире.
21. Каким образом вы определяете чистоту вирусных изолятов в Вашем распоряжении, т. е. соотношение количества вирусных и невирусных (в т.ч. вирусоподобных) частиц в свете проблематичности различения и разделения вирусных и вирусоподобных частиц?
22. В 1983 году Нобелевская премия по физиологии и медицине была вручена Барбаре Мак-Клинток «за открытие мобильных генетических элементов». Мак-Клинток показала, что шоковое воздействие на клетку (например, посредством антибиотиков или других токсинов) провоцирует выработку генетического материала с ранее не детектируемой в пробе последовательностью. Каким образом специалисты ХХХ убеждаются в том, что имеют дело с генетическими последовательностями вируса SARS-CoV-2, а не результатом подобного шока в ходе процедуры по «выделению»?
23. Можете ли предоставить фотографию с электронного микроскопа вирусного концентрата SARS-CoV-2, с которым Вы работали (не отдельного предполагаемого вируса или ситуации в жизни клеточной культуры, а именно однородной массы выделенных однородных вирусов)?[iv]
24. Убедились ли самостоятельно и экспериментально специалисты ХХХ в патогенности вируса, т. е. в том, что в его отношении выполняются постулаты Коха (или их вариант для вирусов — т.н. «критерии Риверса»)?[v] Проявились ли реальные симптомы смертельного заболевания Ковид-19 в живых лабораторных животных или о факте заболевания свидетельствуют только данные анализов и вскрытия? Были ли проведены контрольные эксперименты, исключающие влияние других факторов в развитии симптомов? Под контрольным экспериментом в данном случае мы понимаем введение в животных веществ, подобных предполагаемому вирусному концентрату — например, разложившейся клеточной культуры почек обезьяны, но не под действием предполагаемого вируса, а, например, под действием голода. В каком источнике можно ознакомиться с ходом Ваших работ по выделению и проверке патогенности вируса SARS-CoV-2? Если Вы считаете, что постулаты Коха/критерии Риверса устарели или неприменимы в данном случае, сообщите нам свою аргументацию и как в таком случае Вы определяли патогенность.
25. Проводило ли ХХХ геномное секвенирование полученного непосредственно из проб больных очищенного вирусного концентрата SARS-CoV-2, не имеющего включений другого биологического материала, такого как иных вирусных и невирусных частиц? Просим ответить «Да» или «Нет» с учётом замечания об отсутствии включений другого биологического материала, с комментариями при необходимости. Подтвердило ли оно, что все тестируемые последовательности генов, как указано в п. 8, являются характерными для вируса SARS-CoV-2?
26. Подтверждают ли специалисты ХХХ утверждение CDC (головного федерального ведомства США по борьбе с инфекционными заболеваниями), выраженное в документе экспертной группы по диагностике нового коронавируса 2019-nCoV с помощью ПЦР в реальном времени и обратной транскрипцией от 30 марта 2020 года «CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel» (стр. 38, пункт «Ограничения метода»), о том, что «Обнаружение вирусной РНК не может считаться [1-И.К.] индикатором фактического присутствия заразного вируса или [2-И.К.] того, что 2019-nCoV является причиной клинических симптомов»?

***

[i] В рабочем документе Европейской комиссии от 16 апреля 2020 г. (European Commission, Working Document of Commission Services, Current performance of COVID-19 test methods and devices and proposed performance criteria) указано: «Самая важная информация в отношении методов ОТ-ПЦР для обнаружения SARS-CoV-2 — это последовательности олигонуклеотидов (праймеров и зондов), используемых для амплификации cDNA … за исключением нескольких случаев, нам не удалось найти информации о реальных последовательностях праймеров и зондов, используемых в устройствах».
[ii] Например, в протоколе ВОЗ, посвящённом ОТ-ПЦР в реальном времени для обнаружения SARS-CoV-2, используется праймер nCoV_IP2−12759Rv, состоящий из 18 нуклеотидов (CTCCCTTTGTTGTGTTGT), совпадающих с 8-й хромосомой человека, в чём можно убедиться на сайте GenBank (ncbi.nlm.nih.gov).
[iii] C 1950-х годов в вирусологии утвердилась концепция необязательности выделения вирусных частиц с помощью физических процедур (фильтрации, центрифугирования) и без добавления дополнительных препаратов, хотя оборудование это позволяет. При этом происходит подмена термина «выделение». Вместо «отделение», «отсечение всего лишнего» под ним начинают понимать обратное — «размножение». Последующее наблюдение цитопатического эффекта, т. е. клеточной смерти необоснованно объявляется «выделением» (культуральным методом). При размножении используются препараты, сами по себе способствующие как смерти клетки, так и выработке вирусоподобных частиц (внеклеточных везикул, в т. ч. экзосом) и появлению новых генетических последовательностей. Нет весомых оснований атрибутировать наблюдаемые в результате такой процедуры частицы (как правило, вперемежку с клеточной культурой) к «вирусу». Редкие контрольные эксперименты показывают в таких условиях смерть клеточной культуры с выделением частиц и без добавления «вируса».
[iv] Авторы четырёх главных публикаций о «выделении коронавируса» в ведущих мировых научных журналах на запросы немецкого журналиста Торстена Энгельбрехта о наличии очищенного изолята SARS-Cov-2 и его микрофотографий ответили, что таковыми не располагают (см. http://o.ru.tilda.ws/pcr_tests_hoax).

[v] Статья в журнале Nature (Bao, L., Deng, W., Huang, B. et al. The pathogenicity of SARS-CoV-2 in hACE2 transgenic mice. Nature 583, 830−833 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586−020−2312-y) о выполнении постулатов Коха применительно к новому коронавирусу (где отмечалась «некоторая взъерошенность» мышей, заражённых смертельным вирусом, у двух из которых после умерщвления обнаружили гистологические признаки пневмонии, но настолько слабые, что не повлекли клинической картины. Данные по третьей и последней умерщвлённой мыши из контрольной группы не приведены, сказано лишь, что «признаки пневмонии слабые») — очень спорная, в чём можно убедиться, изучив замечания рецензентов (https://static-content.springer.com/esm/art%3A10.1038%2Fs41586−020−2312-y/MediaObjects/41 586_2020_2312_MOESM3_ESM.pdf) и, тем более, комментарии специалистов на сайте издания, указывающие, в том числе, на подлог в фотографиях. Несмотря на серьёзные замечания и даже отказ в праве быть опубликованной в Nature со стороны одного из рецензентов, статья была опубликована и до сих пор используется fact-checker'ами всех ангажированных структур как доказательство выполнения постулатов Коха. Такова же статья в журнале Science (https://www.science.org/doi/10.1126/science.abb7314), где постулаты «доказали» заражением макак, правда, также не проявивших симптомы.

Илья Коптилин,

Новосибирск,

12 октября 2021 года